Clone le gène GFP dans pUC19 et vérifie ta construction

Un clonage complet, de l'amplification du gène EGFP à la preuve de séquence. L'insert est amplifié avec des amorces portant une queue EcoRI, inséré dans le site EcoRI unique de pUC19 (au cœur de lacZα) et la construction est vérifiée deux fois : par digestion sur gel et par séquençage Sanger.

Projet de recherche

Clone le gène GFP dans pUC19 et vérifie ta construction

Obtenir un clone de DH5α portant pUC19-EGFP, et le prouver par une digestion de vérification et un chromatogramme Sanger.

Les réactifs, cellules et boîtes nécessaires sont sortis des stocks. À vous de choisir l'ordre des manips : les objectifs se valident dans n'importe quel ordre.

Objectifs

1. Amplifier l'insert EGFP avec des amorces EcoRI
Montez une PCR de 25 µL sur pEGFP-N1 avec les amorces EGFP-EcoRI-F et -R (queue CCGGAATTC), puis lancez 30 cycles avec une hybridation à 60 °C.
Revoir « PCR »
2. Digérer l'insert et le vecteur par EcoRI
Deux digestions séparées à 37 °C pendant 1 h dans le tampon 1X : le produit PCR (les queues libèrent les bouts cohésifs AATT) et pUC19 (site EcoRI unique dans lacZα). Inactivez ensuite les enzymes à 65 °C.
Revoir « Enzymes de restriction »
3. Ligaturer l'insert dans le vecteur
Mélangez vecteur et insert (rapport molaire insert/vecteur de 3 pour 1) avec la T4 DNA ligase et son tampon ATP, puis incubez 1 h à 16 °C.
Revoir « Clonage dans pUC19 »
4. Transformer DH5α et cribler en bleu/blanc
30 min sur glace avec l'ADN, choc thermique 45 s à 42 °C au bain-marie, retour sur glace, SOC puis 1 h à 37 °C sous agitation. Étalez 100 µL sur LB-Amp/X-gal/IPTG et incubez la boîte retournée une nuit à 37 °C.
Revoir « Clonage dans pUC19 »
5. Repiquer une colonie blanche et la cultiver
Sous la flamme du bec Bunsen, prélevez une colonie blanche et inoculez 5 mL de LB-ampicilline. Incubez une nuit à 37 °C sous agitation à 220 tr/min.
Revoir « Culture et miniprep »
6. Extraire le plasmide (miniprep) et le quantifier
Lyse alcaline P1/P2/P3 sur 1,5 mL de culture, précipitation à l'isopropanol, lavage à l'éthanol 70 %, culot séché puis reprise dans 50 µL de TE. Mesurez la concentration et le rapport 260/280 au NanoDrop.
Revoir « Culture et miniprep »
7. Vérifier la construction par digestion sur gel
Digérez la miniprep par EcoRI et déposez-la à côté d'une échelle de taille sur un gel d'agarose 1 %. Le vecteur libéré (2 686 pb) et l'insert (726 pb) signent le recombinant.
Revoir « Électrophorèse sur gel d'agarose »
8. Confirmer la jonction par séquençage Sanger
Séquencez 200 ng de miniprep avec l'amorce M13F (−20), qui lit à travers le site de clonage multiple : la jonction EcoRI puis le début de l'EGFP doivent apparaître avec une bonne qualité.
Revoir « Séquençage Sanger »

Témoins

témoin négatif — ligation sans ligase, transformée en parallèle
témoin positif de viabilité — cellules étalées sur LB sans ampicilline
témoin de sélection — cellules compétentes sans ADN sur LB-Amp

Évaluation en direct

Objectifs: 0 / 40
Rigueur: 20 / 20
Contrôles: 0 / 20
Instruments: 0 / 10
Cahier: 0 / 10

Total : 20 / 100

8 objectif(s) non atteint(s).
Contrôle manquant : témoin négatif — ligation sans ligase, transformée en parallèle.
Contrôle manquant : témoin positif de viabilité — cellules étalées sur LB sans ampicilline.
Contrôle manquant : témoin de sélection — cellules compétentes sans ADN sur LB-Amp.
Notez davantage d'observations et d'interprétations dans le cahier de labo.

Modules liés

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