Inactive lacZ et prouve-le

Chez E. coli, une coupure Cas9 non réparée est létale : sans NHEJ ni système λ-Red, les moteurs du labo ne simulent pas l'édition du chromosome bactérien. Le projet applique donc la même logique de perte de fonction à une cible réellement simulée : le rapporteur lacZα de pUC19, inactivé par insertion d'une cassette dans son site EcoRI unique. La preuve est triple, comme pour un KO CRISPR : phénotype blanc sur X-gal, digestion de vérification et séquence de la jonction.

Projet de recherche

Inactive lacZ et prouve-le

Obtenir des clones lacZα⁻ (colonies blanches sur X-gal/IPTG), les comparer aux clones lacZα⁺ (bleus) et prouver l'inactivation par digestion et par séquençage.

Les réactifs, cellules et boîtes nécessaires sont sortis des stocks. À vous de choisir l'ordre des manips : les objectifs se valident dans n'importe quel ordre.

Objectifs

1. Cartographier la cible : linéariser pUC19 par EcoRI
Le site EcoRI de pUC19 est unique et tombe dans le site de clonage multiple, au cœur de la séquence codant lacZα. Digérez 1 µg de plasmide 1 h à 37 °C et vérifiez la linéarisation sur gel : une seule bande de 2 686 pb, plus lente que le plasmide surenroulé non digéré.
Revoir « Enzymes de restriction »
2. Préparer la cassette d'inactivation
Amplifiez la cassette EGFP avec les amorces portant une queue EcoRI (CCGGAATTC), puis digérez l'amplicon par EcoRI pour libérer ses extrémités cohésives AATT.
Revoir « PCR »
3. Insérer la cassette dans lacZα
Ligaturez la cassette dans le vecteur linéarisé (T4 ligase, tampon ATP, 1 h à 16 °C). Le recombinant interrompt le cadre de lecture de lacZα : la α-complémentation est perdue.
Revoir « Clonage dans pUC19 »
4. Transformer et cribler le phénotype sur X-gal
Transformez DH5α (glace, choc 42 °C, SOC, 1 h à 37 °C), étalez sur LB-Amp/X-gal/IPTG et incubez une nuit : les clones lacZα⁺ hydrolysent le X-gal et bleuissent, les clones inactivés restent blancs.
Revoir « Clonage dans pUC19 »
5. Quantifier le taux d'inactivation
Comptez les colonies blanches et bleues de la boîte, calculez la proportion de clones inactivés et notez-la dans le cahier de labo (le rapport blanc/bleu est l'équivalent, ici, du pourcentage d'indels d'un KO CRISPR).
6. Isoler un clone blanc et un clone bleu
Prélevez les deux phénotypes en zone stérile et cultivez-les une nuit en LB-ampicilline : le clone bleu servira de témoin lacZα⁺ à toutes les étapes suivantes.
Revoir « Culture et miniprep »
7. Preuve moléculaire : miniprep et digestion de vérification
Minipreppez les deux clones et digérez-les par EcoRI : le clone blanc libère la cassette de 726 pb en plus du vecteur de 2 686 pb, le clone bleu ne donne qu'une bande.
Revoir « Culture et miniprep »
8. Preuve de séquence : lire la jonction au Sanger
Séquencez la miniprep du clone blanc avec M13F (−20). La lecture quitte le site de clonage multiple de pUC19 pour entrer dans la cassette : le cadre de lecture de lacZα est bien interrompu.
Revoir « Séquençage Sanger »

Témoins

témoin positif lacZα⁺ — clone bleu (vecteur sans cassette) traité en parallèle
témoin négatif — ligation sans ligase (ou vecteur digéré seul) transformée en parallèle

Évaluation en direct

Objectifs: 0 / 40
Rigueur: 20 / 20
Contrôles: 0 / 20
Instruments: 0 / 10
Cahier: 0 / 10

Total : 20 / 100

8 objectif(s) non atteint(s).
Contrôle manquant : témoin positif lacZα⁺ — clone bleu (vecteur sans cassette) traité en parallèle.
Contrôle manquant : témoin négatif — ligation sans ligase (ou vecteur digéré seul) transformée en parallèle.
Notez davantage d'observations et d'interprétations dans le cahier de labo.

Modules liés

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