Éteins la GFP dans des cellules HEK293 et quantifie l'édition

Une expérience d'édition complète sur la lignée HEK293-GFP (transgène EGFP unique) : transfection d'une ribonucléoprotéine Cas9/ARN guide sous poste de sécurité microbiologique, lecture du phénotype au microscope à fluorescence, puis génotypage moléculaire du locus — test T7E1 sur gel 2 % et lecture Sanger pour estimer le spectre d'indels façon TIDE.

Projet de recherche

Éteins la GFP dans des cellules HEK293 et quantifie l'édition

Mesurer l'efficacité d'édition du locus EGFP par deux voies indépendantes : la fraction de cellules GFP⁻ au microscope et le pourcentage d'indels du test T7E1, confirmés par séquençage.

Les réactifs, cellules et boîtes nécessaires sont sortis des stocks. À vous de choisir l'ordre des manips : les objectifs se valident dans n'importe quel ordre.

Objectifs

1. Travailler les cellules sous poste de sécurité microbiologique
Gants, surface désinfectée, flux laminaire du PSM de type II stabilisé pendant au moins 5 min avant d'ouvrir la flasque : la culture de cellules humaines ne se manipule ni à l'air libre ni près d'une flamme.
Revoir « Expérience complète : éteindre la GFP »
2. Transfecter la RNP Cas9/ARN guide et éditer les cellules
Ajoutez 7,5 µL de réactif lipidique puis 5 µL de RNP Cas9/sgEGFP à la flasque, et incubez 72 h à 37 °C sous 5 % de CO₂ : la coupure est complète en 24 h, puis la GFP déjà produite se dilue (demi-vie ≈ 26 h).
Revoir « Réparation : NHEJ et HDR »
3. Compter les cellules GFP⁻ au microscope
Mettez au point en fond clair, passez en épifluorescence avec le cube GFP et capturez une image du pool édité et une du témoin non traité, au même objectif et avec le même temps d'exposition.
Revoir « Expérience complète : éteindre la GFP »
4. Extraire l'ADN génomique et le contrôler
Culottez les cellules à 300 × g (les HEK293 sont fragiles), lysez au SDS avec protéinase K et RNase A à 56 °C, précipitez à l'éthanol, séchez le culot et reprenez dans du TE. Contrôlez le rapport 260/280 au NanoDrop.
Revoir « Génotyper les clones »
5. Amplifier le locus édité (707 pb)
Amplifiez les 707 pb qui encadrent le site de coupure avec les amorces de génotypage (35 cycles, hybridation à 56 °C), sur l'ADN du pool édité et sur celui du témoin.
Revoir « Génotyper les clones »
6. Mesurer le pourcentage d'indels par T7E1
Dénaturez 200 ng d'amplicon à 95 °C puis laissez refroidir lentement pour former les hétéroduplex, ajoutez la T7 endonucléase I 15 min à 37 °C et déposez sur gel 2 % : les bandes de 234 et 473 pb mesurent le taux d'indels.
Revoir « Génotyper les clones »
7. Séquencer et décomposer le spectre d'indels (TIDE)
Nettoyez les amplicons à l'ExoSAP puis séquencez le pool édité et le témoin. La trace du pool se dédouble à partir du site de coupure : comparez-la au témoin (déconvolution façon TIDE, module « Génotyper les clones ») et consignez l'estimation du taux d'indels dans le cahier.
Revoir « Génotyper les clones »

Témoins

témoin positif — cellules non traitées cultivées et génotypées en parallèle
témoin négatif — RNP ajoutée sans agent de transfection (ou cellules sans RNP)

Évaluation en direct

Objectifs: 0 / 40
Rigueur: 20 / 20
Contrôles: 0 / 20
Instruments: 0 / 10
Cahier: 0 / 10

Total : 20 / 100

7 objectif(s) non atteint(s).
Contrôle manquant : témoin positif — cellules non traitées cultivées et génotypées en parallèle.
Contrôle manquant : témoin négatif — RNP ajoutée sans agent de transfection (ou cellules sans RNP).
Notez davantage d'observations et d'interprétations dans le cahier de labo.

Modules liés

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